一、 原理? 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)和雞肉等**樣本中的AHD，在微孔條上預包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免*化學(xué)反應的原理來(lái)進(jìn)行的，樣本中的AHD和微孔條上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃妥因代謝物的衍生物抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣品中的AHD含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線(xiàn)比較即可得出呋喃妥因代謝物含量。 ? 二、 試劑盒技術(shù)指標： 試劑盒靈敏度：??????????0.1 ppb 樣本檢測下限： **、蜂蜜????????????? 0.2 ppb 魚(yú)/蝦等水產(chǎn)品**因存在一定的干擾，檢測下限為0.3 ppb 回收率： 魚(yú)/蝦水產(chǎn)**?????????????  90％±15％ 蜂蜜/雞肉/肝臟樣本??????? ?? 80％±15％ 交叉反應率： 呋喃妥因代謝物???????????? 100％ 呋喃唑酮代謝物?????????? ??0.1％ 呋喃它酮代謝物??????????? ?0.1％ 呋喃西林代謝物??????????? ?0.1％ ? 三、試劑盒組成 1．微量測試孔：96T/8孔 2．標準品液： 0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、8.1 ppb（1.0 ml/瓶） 3．酶標記物??????????? 12 mL 4．抗體工作液??????? ?? 7 mL 5．底物緩沖液???????? ? 7 mL 6．底物液?????????????  7 mL 7．終止液??????????? ?? 7 mL 8．20倍濃縮洗滌液????  50 mL 9．復溶液???????????? ? 50 mL 10．15.1 mg衍生化試劑 ? 四、 所用儀器、試劑 儀器：微孔酶標儀、振蕩器、離心機、天平（感量0.01 g） 各種量程微量移液器 試劑：甲醇、氫氧化鈉、乙酸乙酯、正己烷、濃HCl、磷酸氫二鉀、鄰硝基苯甲醛、亞硝基鐵**鉀（K2Fe（CN）5?NO?3H2O）、ZnSO4?7H2O ? 五、樣本前處理步驟 樣本處理前須知 處理任何樣本時(shí)，都必須注意： 1、實(shí)驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。 2、實(shí)驗之前須檢查各種實(shí)驗器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗結果。 樣本前處理需配制： 1、衍生化試劑 稱(chēng)15.1 mg鄰硝基苯甲醛加甲醇10 mL溶解(濃度10 mM) 2、C液：（供奶樣用）稱(chēng)12.5 g 亞硝基鐵**鉀用去離子水定溶至100 mL。 3、D液：（供奶樣用）稱(chēng)29.8 g **鋅用去離子水溶解定溶至100 mL。 4、0.1 MK2HPO4?稱(chēng)22.8 g K2HPO4?3H2O加去離子水溶解定溶至1000 mL 5、1 M HCl? 取8.6 mL濃HCl加水定溶至100 mL。 6、1 M NaOH 稱(chēng)取4 g NaOH加水定溶至100 mL。 樣本的處理 （a）魚(yú)蝦和肉樣 用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，接(d)的描述方法。 （b）奶樣 1、取出5 mL的樣本到玻璃離心管中，分別加入C液和D液各250 μL； 2.、用振蕩器充分混合樣本,用恒溫離心機4000 r/min以上離心10 min,4-12 ℃。如果沒(méi)有恒溫離心機，則先將樣本降溫至大約8 ℃，然后離心； 3、接(d)的描述方法 （c）蜂蜜 1、取1 g樣本到離心管中； 2、加入4 mL的蒸餾水振蕩溶解，0.5 mL 1 M HCL和100 μL衍生化試劑，充分振蕩； 3、接(d)第2步描述方法。 （d）接上面的方法 1、 取1±0.05 g的均質(zhì)物（魚(yú)蝦/肉樣）、牛奶的離心上清液1.1 mL（相當于1 mL的奶樣），分別加入4 mL的蒸餾水,0.5 mL 1 M HCL和100 μL衍生化試劑，充分振蕩； 2.、在56 ℃過(guò)夜孵育（2 h）； 3、 分別加入5 mL 0.1 M K2HPO4?，0.4 mL 1 M NaOH和5 mL的乙酸乙酯，劇烈振蕩30 s； 4、 在室溫下（20-25 ℃）4000 r/min以上離心10 min； 5、 取出2.5 mL的乙酸乙酯到另一個(gè)容器中于50 ℃氮氣/空氣吹干。 6、 用1 mL正己烷溶解干燥物，用1 mL已稀釋好的復溶液充分混合；在室溫下?? （20-25 ℃）4000 r/min以上離心10 min； 7、 取50 μL下層用于分析。 樣本稀釋倍數：2 ? 六、操作步驟 1、 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2、 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷凍。 3、 加標準品/樣本50 μL /孔，然后加入抗體工作液50 μL/孔，再振蕩混勻，用封板膜蓋板，室溫反應30 min。 4、 洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5、 加入酶標記物100 μL /孔，用封板膜蓋板，室溫反應20 min。 6、 洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 7、 顯色：每孔加入底物緩沖液50 μL，再加底物液50 μL，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色10 min。 8． 測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩勻，設定酶標儀于450 nm處（在20 min內讀完數據），測定吸光度值。 ? ? 七、結果判定 以標準品百分吸光率為縱坐標，以AHD標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線(xiàn)中，從標準曲線(xiàn)上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中AHD實(shí)際濃度。 ? 八、注意事項 1、室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20-25 ℃）會(huì )導致所有標準的OD值偏低。 2、洗板拍干后應立即進(jìn)行下一步操作。 3、混合要均勻，洗板要徹底，否則會(huì )出現重復性不好的現象。 4、反應終止液為2 M**，避免接觸皮膚。 5、將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封 標準物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。 6、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑。 7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之，0標準的吸光度值小于0.6時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。 ? 九、儲藏條件和保質(zhì)期 儲藏條件：試劑盒于2-8 ℃保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒